Hoy en día, la secuenciación del DNA es una herramienta que ha permitido un gran avance en diversos campos de investigación.
¿Qué es la secuenciación del DNA?
La secuenciación del DNA es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo determinar el orden de las bases nitrogenadas (A, C, G y T) de los nucleótidos.
Determinar la secuencia del DNA puede ser útil para su aplicación en varios campos como pueden ser la medicina, la biología, la bioquímica y la genética.
Investigaciones previas y derivadas de la secuenciación
Figura 1. Línea del tiempo de los avances e investigaciones relacionados con la secuenciación.¹
Métodos de secuenciación
A lo largo de la historia han surgido diversos métodos o mecanismos para secuenciar el DNA haciendo que cada vez fuera más rápido y económico este proceso. Los primeros métodos de secuenciación se llevaron a cabo por Fred Sanger con su método enzimático y Maxam y Gilbert con la secuenciación química siendo la primera las más popular. Eso es debido a que la segunda presenta bastante complejidad técnica y utiliza productos químicos peligrosos.
- Método de Sanger o enzimático
El método de Sanger se basa en el uso de la DNA polimerasa i de desoxirribonucleótidos especiales (ddNTP) que no contienen un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la desoxirribosa.² Este hecho provoca la parada prematura de la síntesis de DNA ya que la DNA polimerasa añade nucleótidos a partir de ese extremo. El mecanismo se puede ver detallado en el siguiente video:
Video 1. Animación del procedimiento del método de Sanger.
b. Secuenciación química de Maxam y Gilbert
Este método a diferencia del de Sanger consiste en utilizar productos químicos que generan fragmentos de diferente medida marcados radioactivamente.³ Posteriormente se puede leer la secuencia del DNA mediante una electroforesis en gel de agarosa.
c. Nuevos métodos
Cada día van surgiendo nuevos métodos de secuenciación, nosotros distinguiremos entre los que derivan del método de Sanger (método de secuenciación con terminadores fluorescentes y método de secuenciación automática) y los métodos de secuenciación masiva (Pirosecuenciación, PCR en emulsión e Illumina), además de estudiar los métodos que están surgiendo en este momento:
Método de secuenciación automática
El principio sigue siendo el mismo que el del método de Sanger, es decir, se usan didesoxinucleótidos o ddNTP pero las cuatro reacciones que se hacían por separado ahora se pueden hacer juntas. Eso se hace marcando los ddNTP con fluorocromos diferentes para cada uno.⁴ Entonces el procedimiento sería añadir el DNA que se quiere secuenciar juntamente con un primer o cebador para determinar en qué punto queremos iniciar la secuenciación. Seguidamente se añade la DNA polimerasa dNTP y los ddNTP marcados en una concentración baja. De esta manera se generarán todos los fragmentos posibles marcados al final con un ddNTP que se diferenciarán por un par de bases. Finalmente se hace una electroforesis capilar que permite separar estos fragmentos por peso molecular y se pasa el resultado por un detector. Este aparato proyecta un rayo a una longitud de onda concreto y los fluorocromos responden de una manera concreta pudiendo registrar los resultados. De esta manera puede leer la secuencia de nucleótidos. Este proceso tiene un inconveniente y es que no puede secuenciar secuencias muy largas ya que se va perdiendo resolución como más grande es.
Figura 3. Método de secuenciación automática.⁴
Illumina (2006)
Se trata de un método de secuenciación masiva en la que igual que en la secuenciación de Sanger, se utilizan nucleótidos terminadores marcados con moléculas fluorescentes. Además de la paralelización masiva podemos diferenciar este método del convencional debido a que esta técnica nos permite eliminar la fluorescencia una vez hemos obtenido la imagen y “desbloquear” el carbono que se encuentra en la posición 3` para que así pueda seguir aceptando bases y continuar con la secuenciación, consiguiendo así que la unión de un nucleótido terminador sea reversible.⁵ Este método presenta una mayor capacidad de hacer secuencias en paralelo que los métodos anteriores, lo que permite obtener de una sola vez 6 billones de secuencias.
En cuanto a la mecánica de este método, los primeros pasos consisten en la fragmentación del DNA y a ligación de adaptadores. A continuación, tendrán lugar la amplificación y la reacción de secuenciación.
En la siguiente tabla podemos ver nuevos métodos desarrollados y en desarrollo: 
Tabla 1. Información sobre otros métodos de secuenciación que ya están en el mercado o en gran grado de desarrollo.
Utilidades y aplicaciones de la secuenciación en procariotas
Como ya se ha comentado, la secuenciación consiste en determinar el orden de la secuencia de nucleòtidos ya que estos a su vez corresponden a la información genètica. Esta información es la que determina el funcionamiento de los seres vivos. Entonces determinar la secuencia puede presentar una utilidad relevante en diversos campos de investigación.
Concretamente, la secuenciación de procariotas permite:
Identificación de genes que contribuyen a la enfermedad
Un gran número de procariotas son patógenos. Al hacer un estudio de su genoma, determinar qué gen provoca la enfermedad y su mecanismo de actuación permitiría un mayor avance en la medicina. De esta manera se podrían crear antibióticos más eficientes que en vez de tratar los síntomas ataquen o neutralicen directamente el gen o la proteïna que expresa y causa la enfermedad.
Un ejemplo sería el caso de Neisseria meningitidis que causa la meningitis tipo B. Al descifrar su genoma pudieron determinar una serie de proteínas que producía este microorganismo que a su vez pudieron ser utilizadas para elaborar una vacuna contra esta enfermedad.⁶
Creación de transgénicos y su utilización
El estudio del genoma de diversos procariotas puede permitir crear nuevos microorganismos modificados. Al saber su genoma se pueden usar enzimas de restricción concretos e insertar DNA extracelular para hacer que produzca algún producto en concreto. Un ejemplo típico sería la inserción del gen humano que codifica para la insulina en un procariota como Escherichia coli para que produzca la insulina.⁷ Anteriormente se extraía la insulina de los animales. Este procedimiento de ingeniería genética redujo mucho los costes de producción y evita rechazo por parte del cuerpo al introducirla en un humano diabético haciendo que sea más eficiente.
Estudio de la función de los genes
Mediante la secuenciación del genoma de los procariotas se puede averiguar la funcionalidad de ciertos genes. Un proyecto que se llevó a cabo recientemente fue el del genoma mínimo.
En 1984 se propuso los mycoplasmas como modelos para entender los principios básicos de la vida debido a que eran muy simples y tenían uno de los genomas más pequeños concretamente 525 genes. Mediante la mutagénesis de transposones se demostró que a pesar de su genoma pequeño contiene genes no esenciales. Entonces se propuso descubrir cuáles eran los esenciales y generar la célula más simple posible.⁸ Esta investigación llevó a la creación de Mycoplasma laboratorium que contiene unos 382 genes.
Conclusión
La capacidad de secuenciar el DNA ha permitido acelerar la investigación de diversos proyectos científicos, afectando a diversos campos mencionados anteriormente. Gracias a la secuenciación se puede estudiar el genoma de diversas especies, incluso el genoma humano, y poder determinar cómo puede afectar la alteración en gen a dicha especie. Además, a través de los estudios de la secuenciación se puede llegar a determinar el por qué del rechazo en trasplantes de órganos, por ejemplo, haciendo que el trasplante sea más seguro para el paciente.
Como hemos podido ver, la secuenciación ha ido evolucionando a lo largo de los años, y probablemente este proceso continuará obteniendo cada vez métodos más eficientes.
Esperamos que haya sido de ayuda, si tenéis cualquier duda no dudéis en preguntarnos.
Muchas gracias por vuestra atención.
Lluis Moll, Samara Rabadán, María Martínez y Daniel Belda.
Referencias
- De Necochea Campion, R. Canul Tec, J.C. (2004). Métodos fisicoquímicos en Biotecnología: Secuenciación de Ácidos Nucleicos. Recuperado el 09/03/2016 de http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf
- Rodríguez Tarduchy, G. Santiago Martínez, M.C. Estudio del ADN: Secuenciación automática del ADN. Recuperado el 09/03/2016 de http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm
- .Maxam A. and Gilbert. A new method for sequencing DNA. PNAS, 74 (2), 560‐564, (1977). Articulo donde se describe método químico de secuenciación de ácidos nucleicos.
- Pendientedemigración. Secuenciación de ADN. Recuperado el 09/03/2016 de http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm#Metautomatico
- Bentley, D. R. et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature 456, 53–59 (2008). Artículo de los desarrolladores de Illumina, reportando el uso de esta tecnología para la secuenciación de un cromosoma humano
- Biología celular y molecular. (2013). Aplicaciones médicas del genoma humano. Recuperado el 09/03/2016 de http://biologiabiomolecular.blogspot.com.es/2013/10/aplicacionesmedicas-del-genoma-humano.html
- todosobreDiabetes. ¿Cómo se obtiene la insulina? Recuperado el 09/03/2016 de http://todosobrediabetes.com/como-se-obtiene-la-insulina
- Clyde A. Hutchison III, et al. (25/3/16). Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science,351, 1414. doi 10.1126/science.aad6253
Aquest treball encara li caldria repensar i re-escriure algunes parts. L'estructura general, tot i així, no deixa de ser adequada. És a dir, considerar que el blog es podria estructurar a partir d'una part dedicada al desenvolupament de mètodes i una altra on s'exposéssin diferents aplicacions i utilitats relacionades amb la seqüenciació de genomes bacterians, podria ser ja una estructura bona. Malgrat aquest fet, el blog presenta algunes mancances a nivell de contingut i de forma que caldria corregir. Es poden resumir en tres punts:
ResponElimina1) S'adopta un text més aviat esquemàtic, en alguns casos organitzat per punts. En alguns casos apareixen definicions, com per exemple la del DNA, que no serien del tot necessàries. En aquest sentit, el tipus de text que s'esperaria per un blog divulgatiu hauria de ser organitzat en paràgrafs (i no punts) i més cohesionat. Es tracta d'un text expositiu.
2) En la part dedicada al desenvolupament de mètodes potser seria necessari donar més èmfasi als mètodes recents que han permès l'auge d'aquesta aproximació, i d'altra banda, reduir les explicacions i material gràfic mostrat pel què fa al mètodes antics i aspectes històrics (relacionats amb les fases inicials del seu desenvolupament).
3) L'apartat de Utilitats i aplicacions de seqüenciació en procariotes té diversos exemples on es posa en context la utilitat d'aquestes tècniques en models eukaryotes (fins i tot en alguns casos, el genoma humà). Caldria, doncs, citar exemples relacionats amb els microorganismes procariotes.
Finalment, algunes de les referències es citen en títols o subtítols dels apartats, com per donar a entendre que tot el contingut de l'apartat està basat amb la informació extreta d'un document. Aquest no seria un procediment massa adequat. En aquest cas caldria agafar les referències que es poden trobar en el text que heu fet servir per la consulta i revisar la font documental original. Caldria, per tant, incorporar aquestes noves citacions en l'apartat de referències bibliogràfiques. Compte amb el format, intenteu adequar-lo al proposat en els exemples de la sessió de presentació del Blog.
COMENTARI AVALUABLE:
ResponEliminaEn el método de Sanger (apartado a), por qué la no presencia de el grupo hidroxilo en el carbono 3' provoca que se detenga la síntesis?
Alba Badia Garcia
Eso es debido a que la DNA polimerasa necesita ese grupo hidroxilo que actua como nucleofilo para que se añada el siguiente nucletido, ya que, al hacer esto se forma un enlace fosfodiester con el nucleotido nuevo. Si no hay ese grupo hidroxilo no se puede continuar con el proceso de síntesis i la DNA polimerasa salta interrumpientolo.
EliminaComentario evaluable:
ResponEliminaEn el apartado del método de secuenciación automática por qué la adicción de ddNTP tiene que ser en una concentración baja?
La concentración de ddNTP debe ser baja comparada con la de dNTP ya que si no fuera asi seria mucho más probable que la DNA polimerasa añadiese un ddNTP en vez de un dNTP. Eso provocaria que se parase la síntesis de esa cadena. Si es más probable que se una un ddNTP eso significa que los fragmentos generados tendran tendencia a ser pequeños de tal forma que no se sintetizarian fragmentos grandes.
EliminaLo que nos interesa es obtener todos los tamaños posibles para poder reconstruir la secuencia del DNA y si sucede lo descrito anteriormente no se podria obtener toda la secuencia al faltar los fragmentos mas grandes.
Comentari avaluable:
ResponEliminaDieu que en el mètode Illumina es pot eliminar la fluorescència. Em podríeu explicar una mica com funciona o quin és el procés que s’utilitza? Gràcies
SÒNIA LARA RULL