Expressió de gens de mamífers en bacteris: la producció de insulina

INTRODUCCIÓ.
La insulina humana és una hormona secretada de manera natural per les cèl·lules beta dels illots de Langerhans del pàncrees. Aquesta, és reconeguda per uns receptors de membrana de les cèl·lules diana, que activen els transportadors de glucosa GLUT4, i permeten l’entrada de glucosa a la cèl·lula1. Com a conseqüència, disminueix el nivell de sucre en sang (Figura 1).

Figura 1: Mecanisme d'acció de la insulina.
Font: Fauci et al, 20081.

En les persones diabètiques, la producció de la insulina és insuficient o se sintetitza incorrectament. Com a conseqüència, els receptors no reconeixen la molècula i el transportador GLUT4 no permet l’entrada de glucosa. D’aquesta manera, la glucosa s’acumula a la sang provocant hiperglucèmiaI.

OBTENCIÓ D'INSULINA HUMANA EN BACTERIS.

La insulina humana va ser la primera proteïna produïda per enginyeria genètica, aprovada per l’ús humà l’any 1982. Tot i així, antigament la insulina s'extreia d’organismes amb un metabolisme similar a l’humà, com els porcs i les vaques. Això tenia molts inconvenients perquè el manteniment d’aquests animals era molt més costós i la insulina no era exactament igual a la humana, fet que sovint provocava rebuig.
En el cas de la producció mitjançant enginyeria genètica, la insulina es pot considerar una proteïna recombinantII, ja que és sintetitzada per un organisme que no és l’original. L’obtenció de proteïnes recombinants en microorganismes és un procediment molt interessant ja que és una manera fàcil i ràpida d’obtenir un producte útil. El 30% de les proteïnes recombinants terapèutiques són sintetitzades per Escherichia coli, ja que aquest bacteri prolifera ràpidament i en poc temps es poden obtenir una gran quantitat d’aquestes proteïnes2. Aquest microorganisme és el més utilitzat per a la producció de insulina. Tot i així, també s’utilitzen llevats, majoritàriament del gènere Saccharomyces. Aquests són capaços de dur a terme modificacions post-traduccionals, no produeixen endotoxines durant la síntesi i tenen una major secreció.

PROCÉS DE PRODUCCIÓ DE INSULINA HUMANA EN E. coli.
Per tal d’obtenir la insulina d’origen eucariota mitjançant un organisme procariota, cal seguir una sèrie de passos (Figura 3).

AÏLLAMENT DEL GEN. Els enzims de restricció són enzims propis dels procariotes (molt rars en eucariotes), que reconeixen i tallen seqüències de bases específiques del DNA. In vivo, la seva funció és protegir els procariotes de DNA hostil, com poden ser els genomes vírics3. No obstant, aquests enzims també són necessaris per a la manipulació in vitro del DNA, i són bàsics per a l’enginyeria genètica3. Existeixen tres tipus d’enzims de restricció. Per una banda tenim els enzims de restricció de tipus I i III. Aquests són poc útils per enginyeria genètica, ja que tallen el DNA a una distància variable i inespecífica de les seqüències de reconeixement. Tot i així, són importants in vivo ja que tenen la capacitat de modificar el DNA (per exemple, metilant-lo). Per altra banda, hi ha els enzims de restricció de tipus II, que no tenen capacitat de modificació però tallen el DNA a la seqüència de reconeixement, de manera que són molt més útils per a la manipulació específica d'aquest. Per tal de fer la clonació del DNA (següent pas a seguir), s'utilitzen els de tipus II, ja que interessa aïllar un gen específic3. Per assegurar que posteriorment el gen aïllat pugui ser inserit al seu vector, cal que aquests enzims facin talls escalonats, deixant extrems de cadena senzilla sobresortint, anomenats extrems cohesius, que permeten la correcta insersió del DNA al plasmidi vector (Figura 2).

Figura 2: Esquema general de l'acció dels enzims de restricció.
Font: Madigan et al, 20033.

CLONACIÓ. Un cop s'ha aïllat el gen, aquest ha de ser clonat. L’objectiu de la clonació gènica és obtenir còpies de gens específics d'interès i introduir-los al plasmidi d'un virus (vector). 
La majoria de gens eucariotes tenen la seqüència alterada per la presència d’introns, que han de ser eliminats. Els procariotes no tenen mecanismes per a eliminar-los i per això s’extreuen durant el procés de clonació. Per fer-ho, s’agafa el mRNA (transcrit a partir del gen d’interès, que hem extret per mitjà d’enzims de restricció) després del seu processament, durant el qual es produeix l’eliminació dels introns. Un cop es té aquest RNA, per mitjà d’una transcriptasa inversa, es torna a obtenir el DNA sense introns. Finalment, s'afageix DNA polimerasa per sintetitzar la cadena complementaria i obtenir DNA bicatenari3, 4.

Aquest DNA exempt d'introns ha de ser introduït al vector. Com que el DNA s’ha aconseguit a partir de mRNA, no té promotors ni seqüències reguladores, ja que aquestes no es transcriuen. Per això, cal utilitzar vectors d’expressió amb promotors bacterians i llocs d’unió als ribosomes bacterians per assegurar l’expressió del gen clonat3.

TRANSFERÈNCIA DE DNA. El plasmidi portador del gen d’interès és introduit a la cèl·lula bacteriana mitjançant la transformació, que és un procés per mitjà del qual les cèl·lules bacterianes capten DNA extracel·lular4. Perquè això sigui possible, els bacteris s’han de trobar en estat de competència, que s'aconsegueix amb unes condicions fisiològiques determinades3. Durant aquest estat, la seva paret i membrana presenten alteracions i permeten l’entrada dels àcids nucleics externs a la cèl·lula, de manera que podran captar el plasmidi portador del gen de la insulina5.

EXPRESSIÓ I PURIFICACIÓ. Un cop el vector portador del gen de la insulina ha estat introduït al bacteri per mitjà de transformació, es fa un cultiu d’aquest bacteri en un medi d’agar per tal de que proliferi i s’expressi el gen. A mesura que la proteïna és sintetitzada, es formen cossos d’inclusióIII al citoplasma, que protegeixen la proteïna de la proteòlisi6. Aquests poden ser separats per centrifugació continua, obtenint la insulina humana en estat pur4.  

Figura 3: Esquema general del procés de producció de insulina a E. coli.
Font: Gómez, 20088.

PRODUCCIÓ INDUSTRIAL DE INSULINA.
Actualment la insulina humana es produeix industrialment. La producció mundial de insulina és de uns 20 kg de insulina pura anuals9. La síntesi es dóna dins de bioreactors estèrils que contenen els bacteris amb medi nutritiu sota unes condicions determinades. Es purifica mitjançant la repetició de cicles de centrifugació, filtració i cromatografia. Tot seguit s'asseca i es dilueix amb aigua destil·lada. Finalment s'empaqueta en recipients estèrils i es distribueixen mundialment.

CONCLUSIONS. 
L’expressió de gens propis de mamífers en microorganismes és un mecanisme molt útil i eficient que cada cop s’utilitza més en enginyeria genètica, ja que permet obtenir grans quantitats d’una substància d’interès en un període de temps relativament curt i mitjançant organismes fàcils de cultivar en un laboratori. El descobriment de l’expressió de gens humans en microorganismes també va suposar un gran avanç per la medicina, ja que assegurava l’obtenció de moltes proteïnes humanes de manera relativament fàcil i ràpida.

GLOSSARI.

1. Hiperglucèmia: Augment anormal de la quantitat de glucosa en sang.
2. Proteïna recombinant: Proteïna que s’obté a partir d’una espècie o línia cel·lular diferent de la cèl·lula original.
3. Cossos d’inclusió: Agregats insolubles de proteïnes que es produeixen com a conseqüència d’una situació d’estrès cel·lular7. En el cas de la insulina, els cossos d'inclusió es formen per simple precipitació i agregació de les molècules a causa d’una sobreexpressió proteica6.

BIBLIOGRAFIA.

1. Fauci As, Kasper DL, Braunwald E, hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J. (2008). Harrison's Principles of Internal Medicine, (17). Ciutat: McGraw-Hill Education.
2. Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espín, J., Corchero, J.L., Vázquez, A. y Villaverde, A. (2009). Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories, 8 (17).
3. Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. (2003). Biotecnología. Dins Brock Biología de los Microorganismos. (10a ed., p. 847-860). Madrid: Prentice-Hall.
4. Iranpoor, Hamidreza; Omidinia, Eskandar; Vatankhah, Venus; Gharanjik, Vahid; Shahbazi, Majid . (2015). Expression of Recombinant Human Insulin-like Growth Factor Type 1 (rhIGF-1) in Escherichia coli. Avicenna J Med Biotechnol, 7(3), 101–105.
5. Inohue H, Nojima H, Okayama H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96, 23-28.
6. DC Williams, RM Van Frank, WL Muth, JP Burnett. (1982). Cytoplasmic inclusion bodies in Escherichia coli producing biosynthetic human insulin proteins. Science, 215 (4533), 687-689.
7. Garcia Fruitos, Elena. (2007). Los cuerpos de inclusión bacterianos tienen proteínas funcionales. Universitat Autònoma de Barcelona.
8. Gómez, E. (2008). Terapia insulínica: Revisión y actualización. Educación sanitaria, 27 (10), 73.
9. Cassanello, Miryan. (2011). Conceptos y técnicas de Biotecnologia: Producción industrial de metabolitos [Apunts acadèmics]. Universidad de Buenosaries.